Le terapie a base di RNA sono in fase di sviluppo da oltre 30 anni e il primo farmaco (ONPATTROTM) è stato approvato nel 2018 per il trattamento dei pazienti affetti da amiloidosi mediata dalla transtiretina. Tuttavia, la pandemia COVID-19 li ha spinti alla ribalta con il rapido sviluppo di vaccini basati su mRNA contro il virus SARS-Cov2 da parte di Moderna e BioNTech/Pfizer. Questi vaccini hanno dimostrato di essere notevolmente efficaci e sicuri. Una parte fondamentale della tecnologia sono le nanoparticelle lipidiche (LNP) usate per consegnare l’RNA. L’RNA nudo non può essere semplicemente iniettato perché è immunogenico, facilmente suscettibile di degradazione enzimatica e non viene assorbito dalle cellule. Per superare questi problemi, l’RNA è impacchettato in LNPs che lo proteggono dalla degradazione mentre circola, gli permettono di entrare nelle cellule, poi rilasciano il contenuto nel citoplasma in modo che l’RNA possa essere usato dai ribosomi per sintetizzare la proteina desiderata.
Decenni di ricerca sono andati nello sviluppo e nella formulazione dei lipidi che compongono gli LNP efficaci. Essenzialmente, 4 tipi di lipidi sono necessari per formulare le LNP (proporzioni approssimative tra parentesi):
Lipide ionizzabile. Questo è il componente chiave della LNP (35-50%) e ha due ruoli principali: legare l’RNA e permettere il rilascio dell’RNA nella cellula. Il pKa del lipide è un fattore importante in quanto il lipide deve essere caricato positivamente a basso pH nella LNP per legare l’RNA ma non caricato a pH neutro in modo che la LNP non causi tossicità. Centinaia di lipidi sono stati sintetizzati e vagliati da molti gruppi di ricerca per identificare quelli con le proprietà e gli effetti desiderati. Alcuni candidati di successo includono ALC-0315, cKK-E12, SM-102, e Dlin-MC3-DMA.
Lipide PEGilato. Una piccola quantità di un lipide derivato PEG (0,5-3%) è incorporata per aumentare l’emivita circolatoria nel corpo. I lipidi PEG sono stati anche usati per anni nei sistemi di consegna dei farmaci liposomiali creando i cosiddetti liposomi “stealth”. Inoltre, la percentuale di PEG-lipidi influenza la dimensione del LNP. Gli esempi includono ALC-0159, DSPE-mPEG e DMG-mPEG.
Colesterolo. Il colesterolo è un lipide strutturale “helper” che costituisce una parte significativa del LNP (40-50%) e migliora l’efficacia probabilmente promuovendo la fusione della membrana e favorendo la fuga endosomiale.
Fosfolipide neutro. Fosfolipidi sintetici come DSPC, DPPC e DOPE (~10%) sono anche comunemente usati come lipidi strutturali “helper” nella formulazione di LNP per promuovere il legame cellulare.
Per produrre LNPs contenenti RNA, i lipidi in etanolo e l’RNA in tampone a basso pH sono rapidamente miscelati in un mixer microfluidico. Il lipide ionizzabile è protonato e comincia a legare e incapsulare l’RNA. Il pH viene gradualmente aumentato a 7,4 e l’etanolo viene rimosso, completando la formazione delle LNPs (Figura 1). L’efficienza dell’incapsulamento dell’RNA è abbastanza alta utilizzando la miscelazione microfluidica rispetto alla tradizionale estrusione utilizzata per i liposomi. Le caratteristiche della formulazione LNP come la dimensione delle particelle, la carica superficiale, il targeting dei tessuti, ecc. possono essere personalizzati dal tipo e dal rapporto dei lipidi nella LNP.

Figura 1: Un esempio dei componenti di una nanoparticella lipidica (LNP). Uno strato lipidico esterno composto da lipidi ionizzabili, lipidi PEGilati, colesterolo e fosfolipidi d’aiuto circonda un nucleo di lipidi ionizzabili che incapsula il carico di RNA.
Dopo l’iniezione degli LNP, le particelle sono prese dalle cellule negli endosomi. Il pH diminuisce durante la maturazione endosomiale protonando i lipidi ionizzabili e causando lo scoppio degli endosomi, rilasciando gli LNP nel citosol. Il pH più alto del citosol innesca le LNP a dissociarsi, rilasciando l’RNA per la traduzione ribosomiale e l’espressione della proteina per produrre l’effetto desiderato.
I vaccini a base di RNA attualmente somministrati per prevenire la COVID-19 sono il culmine di due decenni di ricerca e la loro incorporazione nelle LNP è un fattore chiave del loro successo. Inoltre, ci sono innumerevoli applicazioni per altri vaccini e terapie oltre l’attuale pandemia. Con un numero crescente di lipidi per la generazione di LNP ora a disposizione degli scienziati, come potrà utilizzarli per la sua ricerca?
https://www.echelon-inc.com/lipid-nanoparticles-for-rna-delivery/











